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制備色譜純化冬凌草活性成分冬凌草甲素

2014-09-02查看:

冬凌草采用95%乙醇熱浸取法保溫回流30min,過濾,提取液經濃縮得到粗品冬凌草甲素浸膏。粗品冬凌草...

趙新燕 周建民 秦學

聊城萬合工業制造有限公司,山東 聊城252022

冬凌草為唇形科植物碎米椏[Rabdosia rubescens(Hamst)C.Y.Wu.et Hsuan]的干燥地上部分,主要分布于我國黃河流域及其以南各地區,主產于河南太行山南麓各地。冬凌草具清熱解表、消炎止痛、健胃活血等功效,在抗腫瘤方面有較強的活性。冬凌草甲素為冬凌草的有效活性成分,研究[1]發現,生長在河南濟源太行山區8月份冬凌草葉中冬凌草甲素含量最高,它是一種對映貝殼杉烯二萜類化合物。

冬凌草甲素對各種移植性腫瘤細胞具有較大的殺傷,抑制增殖能力,臨床上主要用來治療胃癌、食道癌等癥。冬凌草甲素目前主要從冬凌草植物中分離純化得到,提取方法主要為乙醚提取法、乙醇提取法及中壓柱色譜法等,但這些提取工藝操作周期長,條件不易控制,得到的冬凌草甲素的含量低[2-5]

本文采用反相制備色譜法分離純化了冬凌草甲素,分離工藝簡單,提取率高,所得產品純度高,無污染,為進一步工業化制備型液相色譜分離純化冬凌草甲素提供了基礎。

1  儀器與試藥

高效液相色譜儀含GLP3250泵,可更換泵頭兩個(250ml,GLP色譜工作軟件,UC-3292檢測器;超聲清洗機,PH測定儀。試劑:甲醇,純水,體積分數95%乙醇(均為分析純);冬凌素甲素對照品由河南醫科提供經高效液相色譜檢測純度大于99.5%;冬凌草產自河南濟源市。

2  制備條件

分析條件:色譜柱(ID4.6×250mmC18,粒徑5μm);流動相:甲醇—水(6040);柱溫:38,流速:1ml/min;檢測波長:239nm;進樣體積10μl

制備條件:色譜柱(ID63×700mmDiamonsil C18,粒徑25~40μm);流動相:甲醇—水(55:45);流速:35ml/min;檢測波長:239nm;進樣體積5ml

3  冬凌草甲素的制備

3.1 樣品的處理

參考文獻[6-7]并考慮到各種成本,選用體積分數為95%的乙醇進行熱回流提取。取冬凌草干草粉末120g,放到預熱至80℃1200ml 95%熱乙醇中,保溫回流30min,過濾得提取液。將沉淀再次提取2次,將所有提取液濃縮成膏,即粗品。

3.2  冬凌草甲素的純化

將上節方法制備的冬凌草甲素粗品用制備條件中的流動相配制成體積10mL的溶液,用0.45 μm孔徑的濾膜過濾,作為制備液備用。在2節制備色譜條件下開機,每次進樣5ml,收集相應的流出液,蒸發濃縮干燥,得冬凌草甲素白色粉末。

3.3  制備樣品的質量分數測定

用萬分之一電子天平準確稱取上節制得的冬凌草甲素5mg,用分析色譜條件流動相溶解,定容于25mL容量瓶中,按照反相高效液相色譜測定法[8]進行純度測定,制備的樣品冬凌草甲素質量分數大于99%

4  結果與討論

4.1  流動相的選擇

流速35ml/min,進樣量5ml,考察不同組成流動相下的分離效果和回收率,結果如表1所示。由表1可見,隨著溶劑極性的增大,分離度、保留時間及冬凌草甲素的質量分數逐漸增大,而回收率逐漸減少,綜合分析,選擇甲醇:水為55:45的溶劑體系作為流動相。

4.2  流速的選擇

以甲醇-水(55:45)作為流動相,進樣體積為5ml,測試了流速分別為20253035404550ml/min條件下的樣品分離度、保留時間及純度,結果如表2。由表2可見,隨著

 

 流動相組成對分離冬凌草甲素的影響

 

流動相組成

V甲醇V

分離度

/R

保留時間

/min

冬凌草甲素的

質量分數

w(C20H28O6)/%

回收率

/%

60:40

<1.5

3

95.6

98.5

55:45

>1.5

6

99.1

98.2

50:50

>1.5

7

99.2

97

45:55

>1.5

10

99.2

96.3

40:60

>1.5

12

99.3

96.1

 

 流動相的流速對分離冬凌草甲素的影響

 

流動相的流速

/(ml/min)

保留時間

/min

分離度

/R

冬凌草甲素的

質量分數

w(C20H28O6)/%

20

28

>1.5

99.1

25

12

>1.5

99.3

30

10

>1.5

99.3

35

7

>1.5

99.5

40

5

<1.5

98.7

45

4

<1.5

98.3

50

3

<1.5

97.1

 

流速的增大,冬凌草甲素的保留時間逐漸減少,分離度降低,樣品質量分數先增大后減小,在流速大于35ml/min的條件下,樣品質量分數顯著下降。綜合考慮分離周期、分離度等,選擇以35ml/min為流動相的流速。

4.3  進樣質量濃度的選擇

以甲醇-水(55:45)作為流動相,流速控制在35ml/min,測試了樣品在不同進樣質量濃度下的分離效果,結果見表3.由表3可見,隨著進樣質量濃度的增大,色譜保留時間增長,色譜寬度變大,分離度減小,冬凌草甲素質量分數降低。為保證有較高的生產效率,較高的質量分數,選擇進樣質量濃度為15g/ml

表3  進樣質量濃度對分離冬凌草甲素的影響

 

進樣質量濃度

/[g(生藥材)/ml]

保留時間

/min

分離度

/R

冬凌草甲素的

質量分數

w(C20H28O6)/%

5

3

>1.5

92.7

10

5

>1.5

92.5

15

7

>1.5

92.6

20

10

<1.5

92.3

25

13

<1.5

91.8

 

5  結論

采用制備液相色譜法分離純化冬凌草甲素,分離效果好,分離周期短,所用溶劑對環境無污染。本工藝若120g冬凌草可提取得370mg冬凌草甲素,收率高,可供工業化生產工藝參考。

參考文獻

[1]   ,胡潤淮,,.TLC測定冬凌草葉中冬凌草甲、乙素的含量[J].中國藥學雜志,1998,33(10):611-613.

[2]   云南省醫學科學研究所藥理藥化組.冬凌草甲素的化學及藥理作用研究[J]. 中草藥通訊,1977,(10):57.

[3]   ,胡潤淮,冀春茹,.柱層析法分離制備冬凌草甲素的新工藝[J] .中國中藥雜志,199722(8):478482.

[4]   ,郭兆霞.中壓柱層析法提取分離冬凌草甲素的新工藝[J].黑龍醫藥,2001,14(1):6-7.

[5]   潔,張典瑞,張學順,.超臨界CO2萃取-柱色譜分離聯用制備冬凌草甲素的新工藝的研究[J].中國藥學雜志,2005,40 (23) :1804 1806.

[6]   徐禮,沙世炎,曾紀琰,等.中草藥有效成分分析法,下冊[M].北京:人民衛生出版社,1984 110.

[7]   李吉學,李燕杰,陳百泉.冬凌草甲素提取純化方法[J].河南大學學報, 2010,29 (1):10-12.

[8]   李志平,胡江宇,銀永忠,顏文彬.反相高效液相色潽法測定冬凌草茶中的冬凌草甲素[J].生命科學儀器,200536):38-40.

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